زراعة الأنسجة Tissue Culture
مقدمة :-
يعتبر علم زراعة الأنسجة من المجالات الحديثة الهامة المنتمية حديثاً لعلم الوراثة وهو مجال تطبيقي سوف يحدث ثورة في مجال الزراعة حيث يهتم بتنمية أجراء صغيرة من الأنسجة النباتية Explant والحيوانية يتراوح حجمها تقريباً بين عدة مليمترات إلي ما يقرب من البوصة في الطول علي بيئات صناعية معروفة المكونات وتحت ظروف بيئية متحكم فيها صناعياً ويتم هذا بغرض انقسام ونمو الخلايا وكذلك إعادة التشكل مرة أخرى في هذه الأنسجة لكي يتكون لدينا نمواً من الخلايا Callus أو كائن كامل ] نبات كامل [ ثم يتم نقله وأقلمته للظروف البيئية الزراعية وبذلك يعطي بعض النباتات أو الأصناف ذات مميزات خاصة يستفاد منها استفادة كبيرة في مجال الزراعة وهذا يتم إنجازه في جيل أو جيلين وبذلك لا نلجأ إلي برامج التربية التقليدية التي قد تستغرق من 10 - 15 عام .
وتعتبر الظروف البيئية التي يتعرض لها النسيج من أهم العوامل التي تؤثر علي نجاح عمليات زراعة الأنسجة وهذه الظروف مثل الضوء ( شدته - مدة التعرض له - موجاته ) ودرجة الحرارة ( هل هي ثابتة أو متغيرة حسب الليل والنهار ) والرطوبة ( ملائمة فلا تساعد علي نمو الكائنات الدقيقة وكذلك لا تساعد علي سرعة جفاف البيئة ) .
ولقد حقق المتخصصون في هذا المجال تقدم كبير في زراعة الأنسجة النباتية لما تمتاز به الخلايا النباتية من قدرة علي إعادة الشكل مرة أخرى .
لكن التقدم في مجال زراعة الأنسجة الحيوانية يواجه بعض الصعوبات حيث أن الخلايا الحيوانية ليست لها القدرة علي إعادة الشكل مرة أخرى .
تعريف علم زراعة الأنسجة :-
يقصد بزراعة الأنسجة هو استخدام جزء من النبات قد يكون البذرة أو جزء من الجذر أو جزء من الساق أو جزء من الأوراق أو المتك أو حبوب اللقاح غلي بيئة مغذية غالباً ما تحتوي علي العناصر الكبرى والصغرى ومصدر للسكريات وغالباً ما يستخدم السكروز كبيئة مغذية وأحياناً تضاف بعض من منظمات النمو مثل الأكسينات لتشجيع تكوين الجذور ونموها والسيتكوينيتات لتشجيع نمو الساق والهرمونات التي توجه النبات لتكوين نسيج Callus وهو عبارة عن مجموعة من خلايا منتظمة أو غير منتظمة ونعني بكلمة منتظمة أي أنها خلايا متشابهة لا يمكن تمييز خلايا خاصة بالجذر أو الساق أو الأوراق - وزراعة تلك الخلايا المفككة علي بيئة مغذية يمكن الحصول علي أفراد تشبه النبات الأم الأصلي في تركيبها الوراثي بكميات كبيرة في أوقات قصيرة .
وتتمم هذه الطريقة في ظروف تعقيمية حيث أن البيئات المستخدمة تكون موطن خصب للكائنات الدقيقة .
أهداف استخدام زراعة الأنسجة :-
1 - Rapid clone - Propagation
إكثار النباتات خلال مزارع الأنسجة يمكن أن يحقق :-
أ - True - to - type :-
النباتات المنتجة من نشاط القمم المرستيمية تكون من الناحية الوراثية مطابقة تماماً للنسيج الأم المأخوذة منه القمم المرستيمية مما يؤدي إلي المحافظة علي الصفات الوراثية - وإنتاج نباتات بهذه الكيفية إحدى مميزات التكاثر الخضري للمحافظة علي السلالات .
" Clone " سلالة :- هي النباتات الناتجة بدون تغير وراثي من فرد بمعني أنها سلالة من نبات واحد دون تغير في الصفات الوراثية أي أن جميع النباتات متشابهة وراثياً .
ب - Rapid :-
بمعني سريع … فترة كل خطوة من خطوات زراعة الأنسجة تتراوح من 4- 6 أسابيع فقط .
جـ - Mass production :-
بمعني إنتاج أعداد كبيرة في فترة قصيرة .
تبادل وحفظ التراكيب الوراثية ( الأنواع ) :-
Germplasm Storage and exchange
أ - يمكن خلال زراعة الأنسجة تبادل الأصناف الجديدة والقديمة بين الدول دون الخوف من انتشار الأمراض من الدول المصدرة إلي الدول المستوردة فمثلاً ظهور صنف جديد في منطقة أو دولة ما قد تقف إجراءات الحجر الزراعي والخوف من انتشار الأمراض عائقاً في سبيل نشر هذا الصنف ولكن عن طريق زراعة الأنسجة يمكن التغلب علي هذا العائق .
ب - حفظ التراكيب الوراثية يعتبر هدف عظيم بالنسبة لعلماء التربية حيث يمكنه حفظ أنواع معينة أو أصناف معينة في أنابيب تحفظ في ثلاجات لإيقاف نموها حتى يحتاج إليها في عمليات التربية والتهجين المختلفة وذلك بدلاً من زراعتها في الحقل مباشرةً والمحافظة عليها في الحقل الذي يتطلب كثيراً من الوقت والجهد فضلا عن إمكانية فقدها في أي لحظة بسبب الظروف البيئية والحيوية في الحقل .
إنتاج نباتات خالية من مسببات الأمراض خاصة الفيروسية منها :-
Production of pathogens [mainly virus] - free plants
من المعروف أن بعض النباتات التي يتم إكثارها خضرياً تكون عرضة للإصابة بالأمراض الفيروسية والتي تنتقل من خلال وسائل الإكثار ومن أهم الأمثلة :- البطاطس - الثوم - الفراولة - وغيرها . لذلك فمن خلال مزارع الأنسجة يتمم زراعة جزء صغير جداً 0.2 - 0.5 ملليمتر . هذا الجزء غالباً خالي من الفيروس حتى في النباتات المصابة بالفيروس لعدم احتوائه علي أوعية vesseless وبطئ حركة الفيروس في المنطقة النشطة . النباتات الناتجة من هذا الجزء هي نباتات خالية من مسببات الأمراض وبذلك يمكن توفير ملايين الدولارات التي تستخدم في استيراد شتلات من مناطق باردة حيث لا ينمو الفيروس .
إنتاج العديد من المركبات العضوية والأمصال :-
Pharmacology, Vaccines
كثير من النباتات الطبية والعطرية تنتج مواد عضوية ذات أهمية خاصة طبية وصناعية مثل :-
الداتورا - السكران - الدجيتالس - الريحان - النعناع .
يزرع أجزاء منها لإنتاج نسيج الكالوس CALLUS الذي نستخلص منه المادة الفعالة بدلاً من اللجوء إلي زراعة النبات .
مثال :- إنتاج الكاكاو معملياً
تستخدم مزارع الأنسجة في إنتاج العديد من الأمصال Vaccines بنفس الأسلوب .
مكونات معمل زراعة الأنسجة :-
يتكون معمل زراعة الأنسجة من 4 حجرات هي :-
1 - حجرة المطبخ Kitchen area :-
تتم في هذه الغرفة غسيل جميع الأدوات المستخدمة في هذه الأنسجة مثل الزجاجات , أطباق بتري , المخابير , الماصات وغيرها من الأدوات الزجاجية حيث تغسل بالماء ( ماء مقطر مرتين ) D.D.W فقط ولا يستخدم الصابون مطلقاً .
2 - حجرة الزراعة Cultivation Room :-
ويتم في هذه الغرفة زراعة الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء في البيئات .
3 - حجرة النمو Growth Room :-
يتم في هذه الحجرة نمو الأجزاء المزروعة في البيئات ويجب توفر الظروف التالية في هذه الحجرة :-
حرارة 25 ْ م
ضوء 16 ساعة ضوء فلورسنت أبيض وذلك لأنه يوجد به جميع أطوال موجات الضوء كما أنه لا يؤدي إلي ارتفاع درجة الحرارة .
4 - حجرة التفريد Mist Room :-
في هذه الحجرة يتم تفريد النباتات النامية من الزجاجات أو أطباق تيري في بيت موسى أو تربة معقمة تماماً تحت ظروف متحكم فيها .
وبعد ذلك تجرى له عملية أقلمة ثم ينقل إلي الصوبة أو إلي الأرض المستديمة مباشرةً .
وعملية التفريد هذه تكسب النباتات النامية القوة والتحمل للظروف الطبيعية كي تستطيع الاستمرار في الحياة عند نقلها إلي التربة .
طرق نقل النباتات المزروعة :-
1 - نضع الأصيص في صوبة حتي يصبح متأقلم ونعمل علي رش رزاز متقطع لمدة أسبوع
2 - ننكس إناء زجاجي علي الأصيص في اليوم الأول يكون الإناء محكم وبعد مرور 24 ساعة نرفع الغطاء فترة وجيزة ثم نعيد تنكيسه وهكذا وفي كل مرة نزود فترة رفع الغطاء حتى يتأقلم النبات .
الظواهر المصاحبة لعملية الأقلمة :-
نتيجة عملية الأقلمة تحدث العديد من التغيرات الكيميائية والفسيولوجية والمورفولوجية
أولاً التغيرات الكيميائية والفسيولوجية :-
1 - زيادة نسبة الماء المرتبط غير الحر .
2 - زيادة نسبة السكر المختزل وغير المختزل وقلة النشا .
تحول البروتينات إلي أحماض أمينية .
ثانياً التغيرات المورفولوجية :-
- زيادة الطبقة الشمعية علي الأوراق للحماية من البرودة .
القوام الجلدي للأوراق .
نقص الحجم , حجم الأوراق يقل .
زيادة نسبة المادة الجافة .
قلة نسبة الماء القابلة للتجمد نتيجة ارتفاع الضغط الأسموزي .
الأجزاء النباتية المستخدمة في زراعة الأنسجة Explants :-
تتنوع الأجزاء النباتية المستعملة في زراعة الأنسجة وذلك علي حسب :-
نوع النبات - هدف الدراسة .
فقد نستخدم :-
القمم النامية للبراعم - الجذور - أي جزء من الورقة - برعم جانبي - جزء من الحزم الوعائية للجذور - أو يتم استخدام المتك أو حبوب اللقاح المعزولة أو الأجنة المعزولة عقب التلقيح والإخصاب أو نستخدم البويضات أو المبيض كله وما يحمله من بويضات بعد إزالة أغلفة المبيض .
ويشترط في الجزء النباتي المستخدم :- قدرته علي الانقسام الميتوزي حيث يعتبر اختبار الجزء النباتي المستعمل وكذلك مرحلة نمو هذا الجزء ذات أهمية كبيرة في زراعة الأنسجة وفي جميع الأحوال يجب تعقيم الجزء النباتي المستخدم قبل البدء في زراعة الأنسجة ومن أبسط الطرق المستخدمة في التعقيم هي غمس النسيج في كحول لعدد قليل من الثواني ثم يعامل بمحلول كلوراكس 5 - 15 % لمدة 5 - 20 دقيقة .
طرق التعقيم في زراعة الأنسجة :-
تختلف طريقة التعقيم حسب الجزء المراد تعقيمه كالتالي :-
1 - يتم تعقيم المعمل كلياً بالفورمالين .
2 - يتم تعقيم الأدوات الزجاجية والمعدنية علي درجة حرارة 160 ْ م لمدة 4 ساعات في الاوتوكلاف .
أو في الفرن مباشرةً علي درجة 200 ْم لمدة 4 - 24 ساعة .
3 - يتم تعقيم البيئة في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْم وضغط 15 ضغط جوي لمدة 15 دقيقة .
ولا يمكن تعقيم البيئة في الفرن مباشرةً لعد وجود ضغط به حيث أن الضغط هو الذي يقوم بالتعقيم وقتل الميكروبات وليست الحرارة .
الهرمونات ومنظمات النمو يتم تعقيمها بواسطة المرشحات وهي لها أشكال وطرق مختلفة في التعقيم :-
فبعض منها عبارة عن إناء زجاج من أعلى ومن أسفل إناء آخر وبالمنتصف المرشح حيث يتم وضع الهرمونات أو منظمات النمو أعلى فيحدث لها ترشيح وفصل الميكروبات خلال المرشح ثم تتجمع في الإناء السفلي .
الأجزاء النباتية :-
يتم تعقيمها بالكلوراكس ( هيبو كلورات صوديوم ) 5 % لمدة 15-20 دقيقة .
أو بتركيز 10 % - 20 % لمدة 10 - 30 دقيقة . أو باستخدام الكحول 70 % لمدو 1 - 5 دقائق
أو باستخدام الكحول المطلق 90 % لمدة ثواني ثم الغسيل بالماء المقطر مرتين عدد 2 - 3 مرات .
البذور :- يتم تعقيمها بنترات الفضة أو محلول السليماني .
ملحوظة :-
يمكن استخدام المضادات الحيوية عندما يكون النبات مصاباً من الداخل كوسيلة للتعقيم ويكون النبات المصاب هام جداً فيستخدم المضادات الحيوية مثل الأبسيمين واسع المفعول ومدى استخدامه 50 - 150 ميكروجرام /مم3 .
